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        EMSA(凝膠阻滯實驗)

        更新時間:2022-02-25

        訪問量:424

        廠商性質:生產廠家

        生產地址:

        簡要描述:
        EMSA(凝膠阻滯實驗)驗證性競爭性超遷移EMSA研究DAN結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術
        品牌其他品牌

        EMSA(凝膠阻滯實驗)

        樣本要求

        1、細胞核蛋白或純化的轉錄因子,部分實驗亦可使用重組表達的蛋白,依據實驗設計每張膜至少提供50 uL,濃度大于0.5 mg/mL

        2、探針序列,如無探針序列,請提供DNA結合蛋白相關信息或相關文獻,便于技術人員設計探針3、結合蛋白特異性抗體50uL以上,濃度大于0.5 mg/mL

        EMSA(凝膠阻滯實驗)

        EMSA凝膠/電泳遷移率實驗技術服務常見問題

        1、EMSA原理及方法

        EMSA 稱凝聚阻滯實驗或凝膠電泳遷移率檢測, 是一種用于研究轉錄因子和其相關的 DNA 結合序列相互作用的技術, 能對各類轉錄因子的 DNA 結合活性進行定性和半定量分析,是一項研究細胞信號轉導通路的關鍵實驗技術。

        EMSA 主要基于蛋白-探針復合物在在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據實驗設計特異性和非特異性探針,當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時,樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質與探針形成蛋白-探針復合物;這種復合物由于分子量大,在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢,而沒有結合蛋白的探針則較快;孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后,蛋白-探針復合物會在膜靠前的位置形成一條帶,說明有蛋白與目標探針有互作。

        2、看不到遷移條帶

        1)蛋白樣本提取質量不高,蛋白降解或者提取量不足。

        2)樣本中沒有可以與探針結合的蛋白。

        3)探針與蛋白無特異性的相互作用。

        4)轉膜效率低,蛋白或者探針未轉移到膜上。

        5)曝光或者成像時間過短。

        6) 在 Super-Shift EMSA 測定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白復合物帶還可能有以下原因:

        a. 抗體沒有工作。不是所有的抗體都可以用于 Super-Shift EMSA,只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于 Super-Shift EMSA。

        b. 測定的活化的 DNA/蛋白復合物中沒有希望檢測的構成成分存在。此時既看不到 Super-Shift 的帶,也看不到 DNA/蛋白復合物的量的減少。

        c. 使用的抗體過度稀釋。一般 10~20 ul 的反應液需要使用 0.5~1 ul 原倍的抗體。

        d. 多抗與 DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進膠。在這種情況下,雖然看不到 Super-Shift 的帶,但應當可以看到 DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。

        3、實驗背景高

        1)曝光或者成像時間過長。

        2)封閉時間不足或者效率不高。

        3)洗滌效果不佳。

        4)實驗過程中膜沒有一直處于濕潤狀態。

        5)蛋白的質量不高,雜質多

        4、EMSA如何設置對照實驗及其目的

        EMSA實驗會有如下對照組:
        (1)陰性對照反應(標記探針);
        (2)常規反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針);
        (3)探針冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針+標記探針100倍量的未標記探針);
        (4)突變探針的冷競爭反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針+標記探針100倍量的未標記突變探針);
        (5)Super-shift反應(含激活的目的轉錄因子的核蛋白+標記探針+目的轉錄因子的特異抗體)。

        每個對照組的目的:
        (1)確定探針里面是否有雜質,光有探針,沒有其他成分時,探針的位置,應該位于下方。
        (2)這個是看蛋白和探針的結合,是實驗目的
        (3)看探針結合的特異性。如果冷探針可以競爭結合,阻礙了標記的探針,說明2中的結合是特異的
        (4)目的和3相同。突變的冷探針應該對2的結果沒有影響
        (5)也是判斷特異性,這次是看蛋白的特異性,和抗體結合后,就會有super-shift。如果沒有,說明是其他的蛋白結合。


        5、EMSA非放射性探針設計注意事項

        (1)EMSA探針不宜太長,一般是幾十堿基對。太長會產生過多結合位點導致結果分析困難,還會產生超級螺旋結構而掩蓋結合部位

        (2)注意AT/GC比例

        (3)防止產生空間位阻

        (4)防止錯位配對、封閉成環,排除目標序列以外結合位點

        (5)推薦Biotin或紅外熒光標記,盡量不要用DIG標記。

        相關技術服務:

        1、 DNA親和純化測序(DAP-seq):高通量檢測轉錄因子或DAN結合蛋白在基因組上的結合位點。

        2、 酵母單雜交:DAP-seq后續驗證服務

        3、 ChIP-seq:高效檢測重組蛋白、轉錄因子在基因組的結合位點

        4、 DAP-seq與RNA-seq聯合分析: 分析轉錄因子的靶基因在RNA-seq數據中的表達變化,深入挖掘DAP-seq和RNA-seq測序數據,增加轉錄組測序的分析深度。

        5、 DNA-pull down:鑒定與DNA結合的蛋白。

        6、 精美的論文圖片設計與制作:專業設計師,設計精美論文插圖,提升論文的嚴謹性和美觀度。


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