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        鑒定DNA結合的蛋白-DNA Pull Down技術服務

        更新時間:2022-05-20

        訪問量:577

        廠商性質:生產廠家

        生產地址:

        簡要描述:
        鑒定DNA結合的蛋白-DNA Pull Down技術服務
        DNA Pull Down是一種新穎的DNA-蛋白互作技術,能夠鑒定與特定DNA序列結合的蛋白(轉錄因子或者DNA結合蛋白)。
        DNA Pull Down使用標記的DNA探針作為誘餌,與提取的內源細胞核蛋白進行孵育,捕獲與DNA探針特異性結合的蛋白(比如轉錄因子),最終使用蛋白質譜的方法,鑒定出特異性結合的蛋白。
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        常見問題:

        Q1:DNA Pull Down的原理是什么?

        A:DNA Pull Down是根據啟動子區域,設計DNA探針并進行標記,標記的探針結合到鏈霉親和素修飾的磁珠上,形成磁珠-探針復合體。將磁珠-探針復合體與提取的蛋白孵育,鑒定與DNA探針有特異性結合的蛋白質。


        Q2:探針的設計原則是什么,長度為多少個堿基比較合適?

        A:啟動子的長度一般為100-1000 bp,我們建議選擇起始密碼子上游1000 bp的序列,根據這1000 bp的序列,來設計DNA探針。我們建議探針長度在100 bp-500 bp之間,如果探針序列太短,會降低與蛋白的親和能力;反之,如果探針序列太長,則會增加非特異性結合。


        Q3:做DNA Pull Down的探針,用單鏈好還是用雙鏈好?

        A:轉錄因子是與啟動子區特定的motif結合,DNA雙鏈的正義鏈和反義鏈上都可能會有轉錄因子的結合位點。轉錄因子與DNA的結合依賴于氫鍵和范德華力,雙鏈DNA能夠增加轉錄因子與DNA的結合能力。


        Q4:一般會找到多少個轉錄因子,成功率是多少,有沒有成功的案例?

        A:由于DNA Pull Down的特異性強,假陽性率低,根據我們的實際經驗,一條DNA探針能夠結合1-6個轉錄因子。我們目前所做的項目,成功率為80%。我們鑒定出了作物、花卉和木本植物的WRKY、MYB、HD-ZIP、MADS、HSF等轉錄因子。


        Q5:本實驗的難點在哪里,影響DNA Dull Down實驗的因素有哪些?

        A:由于樣本的種類多種多樣,轉錄因子的表達豐度低,本實驗的難點在于樣本細胞核的分離、細胞核蛋白的提取。影響DNA Dull Down實驗的因素主要有蛋白的表達豐度、蛋白和DNA結合的強弱程度等。


        Q6:SDS PAGE之后,為什么用銀染,而不是考染?

        A:由于提取或洗脫的蛋白豐度低,所以使用銀染進行SDS PAGE后的染色,銀染檢測靈敏度高,能夠檢測到ng級的蛋白質。通過銀染,也能夠判斷蛋白提取的質量,以及Pull Down之后蛋白洗脫的效果。


        Q7:為什么實驗的對照組也能夠鑒定出蛋白?

        A:如果物種蛋白數據庫完整度低、肽段注釋質量差,則需要進行全庫搜索。全庫搜索,對于負對照和實驗組來說,往往有非特異性蛋白或肽段。這是因為有一些蛋白能夠與磁珠非特異性結合;另外,配制實驗緩沖液所用的原料試劑、在實驗過程中會有外部環境蛋白的污染,比如人的角蛋白污染。由于質譜鑒定的靈敏度很高,即使有痕量的蛋白污染,也會被檢測出來。


        Q8:后續的驗證可以選擇哪些實驗?

        A:后續可以使用酵母單雜交、EMSA、LUC等實驗做進一步驗證。

         

         

         

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